Eingekapselte aus Stammzellen gewonnene β-Zellen üben bei Patienten mit Typ-1-Diabetes eine Glukosekontrolle aus

Globale Beschreibung der klinischen Studie

Bei dieser Studie handelt es sich um eine erste offene Phase-1/2-Studie am Menschen zur Sicherheit, Verträglichkeit und Wirksamkeit von VC-02 bei Patienten mit T1D und Hypoglykämie-Unbewusstsein. VC-02 ist ein Kombinationsprodukt aus PEC-01-Zellen, die in ein Abgabegerät geladen werden. Die Studie wird an neun Zentren in Nordamerika und einem Zentrum in Belgien durchgeführt (ClinicalTrials.gov-Kennung: NCT03163511). Dieses Papier ist ein Zwischenbericht über einen Kader von 10 Patienten in der größeren Studie. Die Patienten wurden in City of Hope behandelt; die University of British Columbia; die University of California, Davis; die University of Minnesota; und Vrije Universiteit Brussel. Eine detaillierte Beschreibung des klinischen Protokolls wird als Ergänzungsprotokoll bereitgestellt.

Zu den Einschlusskriterien gehörten Männer und nicht schwangere Frauen, eine T1D-Diagnose seit mindestens 5 Jahren, mangelndes Bewusstsein für Hypoglykämie (Clarke-Score) oder signifikante glykämische Labilität, ein stabiles Diabetes-Behandlungsschema, die Bereitschaft, ein CGM-Gerät zu verwenden und ein akzeptabler Kandidat dafür zu sein chirurgische Implantation. Ein Clarke-Score ≥4 bestätigte, dass sich Patienten aufgrund der Hypoglykämie-Unkenntnis für die Studienteilnahme qualifizierten. Zu den Ausschlusskriterien gehörten eine Vorgeschichte von Inselzell-, Nieren- und/oder Pankreastransplantationen; sechs oder mehr schwere unerklärliche hypoglykämische Ereignisse innerhalb von 6 Monaten nach der Einschreibung; unkontrollierte oder unbehandelte Schilddrüsenerkrankung oder Nebenniereninsuffizienz; diabetische Komplikationen wie schwere Nierenerkrankung oder Nierenfunktionsstörung, proliferative Retinopathie, Fußgeschwüre, Amputationen und/oder schwere periphere Neuropathie; oder nachweisbares stimuliertes Serum-C-Peptid während des Screening-Zeitraums, definiert als ≥0,07 nmol l⁻¹.

Nach der Erstellung eines Sicherheitsprofils des Produktkandidaten in Kohorte 1 wurde die Produktwirksamkeit in Kohorte 2 bewertet. Innerhalb von Kohorte 2 wurden Patienten in Kader (Patientengruppen von N = 4 bis N= 11) zum Testen einer bestimmten Gerätekonfiguration und/oder Implantationsstrategie, um die Ergebnisse der Produkttransplantation und des Zellüberlebens zu verbessern. Alle Gerätekonfigurationen enthielten die gleichen Materialien, unterschieden sich jedoch in der Anwendung der Poren. Unterschiede in der Implantationsstrategie betrafen pharmakologische Eingriffe, die Anzahl der implantierten Dosisfindungseinheiten und/oder die Implantationsstellen. Die in Lit. beschriebenen Patienten. ^17,18 waren in früheren Studiengruppen der Kohorte 2 eingeschrieben. Die im vorliegenden Bericht beschriebenen Personen nahmen an der jüngsten teil (Einschreibung zwischen August 2020 und Oktober 2021); Sie erhielten Geräte mit den gleichen Materialien wie die Geräte in früheren Studiengruppen, jedoch in zwei- bis dreifach höherer Anzahl und mit einer anderen Anwendung von Perforationen (beschrieben in der Patentanmeldung US16/347,790). Das Protokoll spezifizierte den primären Wirksamkeitsendpunkt als Veränderung des Plasma-C-Peptids nach MMTT vom Ausgangswert bis zur 26. Woche und die folgenden sekundären Wirksamkeitsendpunkte für die Nachbeobachtung bis maximal 104 Wochen:

• Veränderung der C-Peptid-Reaktion auf MMTT gegenüber dem Ausgangswert und Prozentsatz der Patienten, die Werte von >0,07 nmol l erreichen⁻¹;

• Veränderung der durchschnittlichen Insulindosis gegenüber dem Ausgangswert und des Prozentsatzes der Patienten mit einer Reduzierung um 50 % und des Prozentsatzes mit Insulinunabhängigkeit;

• Prozentsatz der Zeit mit Blutzuckerwerten <54 mg dl⁻¹54 mg dl⁻¹ bis <70 mg dl⁻¹70 mg dl⁻¹ bis ≤180 mg dl⁻¹ und >180 mg dl⁻¹ (CGM-Gerät) und Veränderung der Zeit im hypoglykämischen Bereich gegenüber dem Ausgangswert (<70 mg dl).⁻¹), Zeit im euglykämischen Bereich (70–180 mg/dl⁻¹) und Zeit im hyperglykämischen Bereich (>180 mg dl).⁻¹);

• Häufigkeit hypoglykämischer Ereignisse (HEs) und Prozentsatz der Patienten ohne HE.

Klinisches Protokoll

Die Patienten erfüllten die Aufnahmekriterien, einschließlich Hypoglykämie-Wahrnehmung, Plasma-C-Peptid <0,07 nmol l⁻¹ während MMTT, HbA1c ≤ 10 % und unterschriebene Einverständniserklärung. Das klinische Protokoll verwendete eine Immunsuppression mit Anti-Thymozyten-Globulin (ATG) zur Induktion und Tacrolimus und Mycophenolatmofetil zur Aufrechterhaltung, wie in Lit. ^17,18. Die ATG-Dosis wurde an die Lymphozytenzahl angepasst. Zwei Tage nach Beginn der ATG wurden die Geräte unter Vollnarkose subkutan in der Bauchdecke und den Flanken platziert. Während und nach den Eingriffen wurden keine unerwünschten Ereignisse registriert.

Wie im Studienprotokoll vorgeschrieben, wurden alle CGM-Daten mit einem Dexcom G6 CGM-Sensor erfasst. Die Blutzuckerkontrolle und die Insulinverabreichung wurden von einem Diabetesberater geleitet, der unabhängig vom Studienteam war und keine Kenntnis von den Plasma-C-Peptid-Spiegeln hatte. Zur medizinischen Nachsorge waren regelmäßige Krankenhausbesuche geplant, einschließlich einer systematischen Untersuchung unerwünschter Ereignisse, der Erhebung von Labordaten und der Anpassung der Dosierung der Immunsuppression bei Bedarf. Der Automodus von CGM Medtronic wurde mindestens 4 Stunden vor Beginn der MMTT gestoppt und der Patient wurde auf eine feste Insulindosis umgestellt, die während des Tests beibehalten wurde. Die gemischte Mahlzeit bestand aus Boost Hi-Protein (Volumen 360 ml) und wurde innerhalb von 15 Minuten eingenommen. Vor der Mahlzeit wurde kein Insulinbolus verabreicht.

Ein MMTT wurde 4 Wochen vor der Transplantation und alle 3 Monate nach der Transplantation durchgeführt. Alle 30 Minuten wurde Blut zur Messung des Blutzuckerspiegels und des C-Peptids entnommen, mit dem Ziel, Empfänger zu identifizieren, deren Plasma-C-Peptid zwischen dem Ausgangswert und Monat 6 (primärer Wirksamkeitsendpunkt) anstieg, und diejenigen, die einen Wert von >0,07 nmol·l erreichten⁻¹ (sekundärer Wirksamkeitsendpunkt) während einer 12-monatigen Nachuntersuchung. Für diese Beurteilung wurde wie üblich der 90-Minuten-Zeitpunkt im MMTT ausgewählt; Die gleichzeitige Glykämie betrug >250 mg dl⁻¹ für alle Patienten und wird daher als ein ähnlicher glukosestimulierender Zustand für alle angesehen. Die Glukosereaktion wurde durch Vergleich der C-Peptid-Werte nach 0 Minuten und nach 90 Minuten bewertet. Für den Endpunkt von Fall 3 (Monat 12) wurde dieses Glykämiekriterium erst bei Minute 120 erreicht und lieferte somit die aufgeführten Daten. Die Nachbeobachtung wurde für die MMTT im 9. und 12. Monat des Falles mit der höchsten C-Peptid-Reaktion im 6. Monat auf 360 Minuten verlängert, um die Freisetzung von C-Peptid und Proinsulin während einer längeren Glukosestimulation zu verfolgen.

Die Glukose-, C-Peptid- und HbA1c-Werte wurden von ACM Global Laboratories mithilfe von Hexokinase-, Chemilumineszenz- bzw. Ionenaustausch-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-Assays analysiert. Für einen Punkt (Fall 3, Monat 9) war der CRO-Wert für C-Peptid nicht nachweisbar und unterschied sich vom lokalen Krankenhauswert (0,10 nmol·l).⁻¹) sowie mit den vorherigen und folgenden CRO-Werten bei diesem Patienten, so dass wir denken, dass es fehlerhaft ist und durch den lokal gemessenen Wert ersetzt werden kann. Proinsulin wurde nur in den MMTT-Proben von Fall 1, Monat 12, gemessen; Die Werte wurden mit digitaler ELISA-Technologie (SIMOA HD1, Quanterix) ermittelt. Wie in früheren Protokollen führte der Beginn der Immunsuppression zu einem vorübergehenden Rückgang der Blutzellzahl und des HbA1c-Spiegels.

Implantation von PEC-Direct

Das PEC-Direct-Kombinationsprodukt wurde von ViaCyte als perforierte Geräteeinheiten hergestellt, die PEC-01 enthielten, das aus der pluripotenten Stammzelllinie CyT49 differenziert worden war^6,16. Die Zellen wurden in Dosisfindungs- und Sentinel-Einheiten geladen, wo sie zwischen Polytetrafluorethylenmembranen mit Poren in kontrollierter Verteilung, Anzahl und Durchmesser zurückgehalten wurden. Die Dichte der Poren ist bei beiden Geräten identisch, ebenso die Dicke; Daher wird erwartet, dass Transplantation, Diffusion und Perfusion ähnlich sind. Die Skalierung des Dosisfindungsgeräts beträgt 12× für den Bereich, der Zellen enthält; sie enthalten schätzungsweise 75 × 10⁶ PEC-01-Zellen im Vergleich zu 7 × 10⁶ PEC-01-Zellen in den Sentinels. Die Sentinel-Geräte wurden an derselben Implantationsstelle eingeführt, am gegenüberliegenden Ende eines Einschnitts, der zur Platzierung des Dosisfindungsgeräts verwendet wurde. Diese Einheiten wurden bei ViaCyte hergestellt (Ref. ¹⁶ und ergänzende Informationen) und in einem Behälter, der bis zu 5 Tage lang eine Temperatur von 15–25 °C aufrechterhält, an die Implantatzentren versandt.

Histologie

Entnommene Wächter mit umgebendem Gewebe wurden in Formaldehyd fixiert, bevor sie in Paraffin eingebettet und geschnitten wurden (5 µm). Für die Histologie wurden die Schnitte mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt. Zur Unterscheidung männlicher Spenderzellen von weiblichen Empfängerzellen (Fall 1) wurde der RNAscope 2.5 HD Assay RED (Kat.-Nr. 322350, Advanced Cell Diagnostics) gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet (15 Min., Target Retrieval; 30 Min., Protease Plus). ). Die verwendete Sonde war Ein weiser MannKDM5D (Kat.-Nr. 558161), ein Gen auf dem Y-Chromosom. Da die CyT49-Zelllinie männlichen Ursprungs und der Empfänger weiblich ist, unterscheiden KDM5D-positive (rote) Signale Spender- und Empfängerzellen. Die RNA-in-situ-Hybridisierung wurde in der VSTA-Einrichtung der Vrije Universiteit Brussel https://vsta.research.vub.be durchgeführt.

Für die immunhistochemische Analyse wurden die Schnitte einer hitzeinduzierten Antigengewinnung (2100-Retriever, Aptum Biologics) in Citratpuffer (ScyTek Laboratories) unterzogen, bevor sie mit Meerschweinchen-Anti-Insulin und Kaninchen-Anti-Glucagon (jeweils 1:1.000, selbst hergestellt) gefärbt wurden. , Maus-Anti-Glucagon (1:500, g2654, Sigma-Aldrich), Ratte-Anti-Somatostatin (1:100, ab30788, Abcam), Maus-Anti-CK19 (1:20, M0888, Agilent), Kaninchen-Anti-Breitspektrum CK (1:200, z0622, Agilent), Maus-Anti-CHRA (1:500, Ma5-13287, Thermo Fisher Scientific) und Kaninchen-Anti-CD34 (1:150, ab81289, Abcam). Alexa Fluor-konjugiertes F(ab′)₂ Fragmente affinitätsgereinigter Antikörper wurden als Sekundärantikörper verwendet, die eine Mehrfachmarkierung ermöglichten (1:500, Jackson ImmunoResearch). Die Kerne wurden mit DAPI (Sigma-Aldrich) gefärbt, das dem Eindeckmedium (Agilent) zugesetzt wurde. Digitale Bilder wurden mit einem Axioplan 2-Mikroskop (Carl Zeiss) mit einer Orca-R2-Kamera (Hamamatsu Photonics) und SmartCapture 3-Software (DSUK Ltd.) oder mit einem Aperio CS2 (Leica Biosystems) aufgenommen und mit der Pathomation-Software visualisiert. Die Morphometrie wurde an .tiff-Bildern durchgeführt, die mit ImageXpress Pico (Molecular Devices) aufgenommen und halbautomatisch mit der IPlab-Software (Becton Dickinson) analysiert wurden.

Die Zusammensetzung des Gewebes in der inneren Kammer wurde wie in Lit. beschrieben bestimmt. ⁴⁰. In früheren Arbeiten haben wir die Anzahl der gleichmäßig verteilten Abschnitte ermittelt, die für diesen Implantattyp repräsentativ sind. Diese Zahl wurde für DAPI (Marker für Kernmasse) sowie für Insulin, Glucagon und CHRA und CK (zytoplasmatische Pankreaszellmarker) gefärbt. Für jede Färbung wurde der positive Bereich in einem Abschnitt halbautomatisch quantifiziert und nach der Cavalieri-Methode auf ein Gesamtvolumen für den angegebenen Marker extrapoliert: Der Wert wurde mit der Entfernung zum nächsten Abschnitt multipliziert, was ein Volumen für diesen Bereich ergibt , und alle Regionsvolumina wurden addiert, um das Gesamtvolumen für das Implantat zu erhalten. Die Kernmasse wurde auch als Prozentsatz der Ausgangsmasse (2,5 µl) ausgedrückt und durch Anwendung eines Umrechnungsfaktors, der zuvor in auf DAPI und Aktin gefärbten Stammzellpräparaten definiert wurde, in die Gesamtzellmasse umgerechnet. Diese Gesamtzellmasse setzt sich aus der Masse der infiltrierten Empfängerzellen und der Masse der Pankreaszelltypen des Spenderursprungs zusammen. Insulinpositive und Glucagon-positive Zellen waren CHRA-positiv. Die Summe der CHRA-positiven Masse und der CK-positiven Masse wurde als Masse der Spenderherkunft herangezogen; Sein prozentualer Anteil an der gesamten Zellmasse ermöglichte die Berechnung der Wiederherstellung der anfänglichen Zellmasse sowie des Anteils der infiltrierenden Empfängerzellen (Tabelle 2).

Das Vorhandensein und der Phänotyp von Lymphozyten wurden durch immunhistochemische Färbung für CD4 (SP35), CD8 (SP57), CD20 (L26) und CD68 (KP1) identifiziert. Die Objektträger wurden mit einem Aperio GT450 bei 40-facher Vergrößerung gescannt und mit der Pathomation-Software visualisiert.

Ethik-Erklärung

Alle Patienten unterzeichneten eine Einverständniserklärung, in der auch die Existenz anderer Behandlungsformen angegeben wurde, die der Studienarzt vor seiner Entscheidung erläutern musste. Die Einwilligung beinhaltete eine Vereinbarung über die Erhebung und Nutzung von Studiendaten zu Forschungszwecken und im Zusammenhang mit wissenschaftlichen und medizinischen Publikationen. Alle Studienstandorte wurden vom örtlichen Prüfungsausschuss ihrer Einrichtung genehmigt. Der Versuch wurde unter Einhaltung aller geltenden Vorschriften durchgeführt.

Zusammenfassung der Berichterstattung

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.