Gen-Editing-Technologie von CRISPR führt zu neuen Erkenntnissen über hypertrophe Kardiomyopathie

Die hypertrophe Kardiomyopathie (HCM) ist die häufigste aller genetisch bedingten Herzerkrankungen und die häufigste Ursache für den plötzlichen Herztod. Sie zeichnet sich durch eine abnormale Verdickung des Herzmuskels aus, die im Laufe der Zeit zu einer Herzfunktionsstörung und schließlich zu einer Herzinsuffizienz führen kann.

Ein im veröffentlichtes Papier Proceedings of the National Academy of Sciences (PNAS) und Co-Autor von Beth Pruitt, Professorin für Maschinenbau an der UC Santa Barbara und Direktorin des Institute for BioEngineering des Campus, beschreibt die Ergebnisse einer komplexen langfristigen Zusammenarbeit, an der Forscher der Stanford University und der University of Washington beteiligt waren , und der University of Kentucky. Die Studie hat zu einem neuen Verständnis darüber geführt, wie genetische Mutationen auf zellulärer Ebene HCM verursachen, und zu neuen Perspektiven, wie man es verhindern kann.

In ihrer Arbeit erklären die Autoren, dass mehr als tausend genetische Mutationen identifiziert wurden, die HCM verursachen. Die meisten von ihnen finden sich in Genen, die sarkomerische Proteine ​​kodieren, die strukturellen Bausteine ​​des Herzmuskels, die für die Erzeugung und Regulierung von Kontraktion und Entspannung verantwortlich sind. Etwa ein Drittel der Mutationen befindet sich im Beta-Herzmyosin, dem primären Protein, das die Kontraktion der Herzzellen antreibt. Die Kontraktion des Herzmuskels und jedes anderen Muskels in unserem Körper resultiert aus einem Prozess, bei dem das Motorprotein Myosin entlang einer Kette von Aktinmolekülen “läuft”, ein Prozess, der als Kreislauf überqueren. Dabei wird chemische Energie in Form von ATP in mechanische Energie umgewandelt, was letztendlich zur Herzkontraktion führt.

Vor einer Kontraktion wird der Kopf eines Strangs eines ineinander verschlungenen zweisträngigen Myosinmoleküls gegen ein Aktinmolekül gezogen. Die Muskelkontraktion wird eingeleitet, wenn ein ATP-Molekül, bekannt als “Energiewährung” biologischer Systeme, an den Myosinkopf bindet. Der Myosinkopf und das daran gebundene ATP lösen sich dann vom Aktin, wodurch die Hydrolyse des ATP eingeleitet wird, das in ADP plus eine Phosphatgruppe umgewandelt wird. Dieser Prozess setzt Energie frei, die das Myosin-Protein in einen hochenergetischen Zustand “spannt” und die Form des Myosins verändert, so dass es bereit ist, entlang des Aktins zu kriechen. An diesem Punkt wird das Phosphat aus dem Myosin freigesetzt, wodurch das Myosin auf das Aktin drückt und das Phosphat freisetzt, was dazu führt, dass das Myosin zur nächsten Aktinkette wandert und den Muskel zusammenzieht. All dies, bei dem Millionen von Myosinköpfen in Schritten von Mikrosekunden über Aktin laufen, muss mit der richtigen Geschwindigkeit erfolgen, um die Gesundheit des Herzens zu erhalten.

Da HCM häufig bei Patienten mit Mutationen im Beta-Herzmyosin-Protein beobachtet wird, wurde die Hypothese aufgestellt, dass HCM-Mutationen eine Kaskade von Ereignissen verursachen, die sich letztendlich in einer Schädigung des Herzens selbst manifestieren. Diese Studie stellte diese Idee auf die Probe und konzentrierte sich auf eine einzelne Mutation, P710R, die die In-vitro-Motilitätsgeschwindigkeit – die Geschwindigkeit, mit der der Myosinmotor auf Aktin läuft – im Gegensatz zu anderen MYH7-Mutationen, die zu einer erhöhten Motilität führten, dramatisch verringerte Geschwindigkeit.

Die übergreifende Forschungsfrage dieses Projekts bestand darin, herauszufinden, wie eine Mutation im Zusammenhang mit einer Herzerkrankung bei Patienten die Herzfunktion auf zellulärer Ebene verändert.

Das Team verwendete die CRISPR-Technologie, um vom Menschen induzierte pluripotente Stammzell-Kardiomyozyten (Zellen, die für die Herzkontraktion verantwortlich sind) zu bearbeiten, indem es die P710R-Mutation in sie einfügte. Pruitt leitet die Stammzellbank an der UCSB, wo “saubere” Zelllinien ohne genetische Anomalien gepflegt und für Universitätsforscher reproduziert werden. Solche sauberen, mutationsfreien Linien bieten einen perfekten Maßstab für den Vergleich mit Zellen, um die Auswirkungen der P710R-Mutation sehr genau zu sehen. Zum Beispiel testet das Forschungsteam jetzt die Auswirkungen verschiedener Mutationen im Zusammenhang mit Herzerkrankungen im gleichen genetischen Hintergrund.

“Sie können zehn Menschen mit derselben Genmutation in diesem Protein haben, und sie können unterschiedliche klinische Bedeutung haben, weil der Rest ihres Genoms anders ist; das macht uns zu Individuen”, sagte Pruitt. “Mit diesen Zeilen können wir untersuchen, was das Ergebnis der genetischen Mutation ist. Durch den Vergleich der Auswirkungen verschiedener Mutationen können wir beginnen, auseinanderzusetzen, wie diese Veränderungen zu HCM führen. Es ermöglicht uns, genau zu untersuchen, wie und warum sich die Zellen daran anpassen.” die Mutation auf diese Weise zu erhalten und Daten zu erhalten und sie mit der Dicke der Herzwand und all den anderen Dingen, die stromabwärts passieren, in Beziehung zu setzen.”

Diese Forschung begann vor fast 15 Jahren, als Pruitt noch in Stanford war, und führte zu dieser gemeinsamen Arbeit. Die CRISPR-Technologie ermöglicht es Forschern nun, Zellen zu entwerfen, die spezifische Mutationen exprimieren, die mit Herzerkrankungen in Verbindung stehen, und dann molekulare und funktionelle Veränderungen zu bewerten, um die zellulären Auswirkungen einzelner Mutationen zu bestimmen, die bei Patienten mit HCM identifiziert wurden. Diese Studien werden ein mechanistisches Verständnis dafür liefern, wie einzelne Mutationen auf molekularer Ebene bei Patienten auf HCM übertragen werden.

In diesem Projekt wurden die Zellen nach der Einführung der Mutation in einer Zusammenarbeit zwischen dem Pruitt-Labor (UCSB) und dem Bernstein-Labor (Stanford University) mit Zugkraftmikroskopie untersucht, einem Assay, der die gleichzeitige Beobachtung einer schlagenden Zelle und der Kraft, die es erzeugt. Das Spudich-Labor (Stanford) führte separate Studien desselben mutierten Proteins auf molekularer Ebene mit einer optischen Falle durch, bei der leichter Druck ausgeübt wird, um die Position und Kraft einer Aktin-“Hantel” genau zu kontrollieren, die zwischen den Kügelchen gehalten wird, während die Myosinköpfe laufen entlang des Aktins, um den Leistungszyklus von Myosin zu messen. Der Test zeigte, dass die P710R-Mutation die Schrittweite des Myosinmotors (dh die Länge jedes Schrittes) und die Geschwindigkeit, mit der sich das Myosin von Aktin ablöst, verringert.

In einer Zusammenarbeit mit dem Forscher der University of Kentucky, Kenneth Campbell, wurden diese Beobachtungen dann mit einem Computermodell verglichen, das zeigt, wie die Myosinmotoren in der Zelle interagieren, um Kraft zu erzeugen. Die Ergebnisse bestätigten eine Schlüsselrolle bei der Regulierung des sogenannten „super-entspannten Zustands“ von Myosin. Wie Pruitt erklärte, „verbringen Myosinköpfe viel Zeit in einem superentspannten Zustand, was darauf hinweist, wenn sie von Aktin getrennt sind. Jede Mutation oder jedes Medikament, das ändert, wie lange oder wie stark Myosinmotoren an Aktin gebunden sind, verändert die Zellkraft Produktion und Veränderung nachgelagerter Signalereignisse, die Umbau und Wachstum oder Hypertrophie vorantreiben.”

Es wurde festgestellt, dass die P710R-Mutation in dieser Studie den superentspannten Zustand destabilisiert. Infolgedessen werden in Zellen, die die Mutation tragen, mehr Myosinköpfe an Aktin gebunden, was die Zunahme der Kraft erklärt, die in diesen Zellen beobachtet wurde.

Für Pruitt ist neben den wichtigen wissenschaftlichen Erkenntnissen der Wert einer nachhaltigen Zusammenarbeit eine wichtige Erkenntnis aus der Arbeit. “Die Skalen, die das Papier abdeckt, sind normalerweise nicht Gegenstand der Forschung in einem Labor oder sogar in zwei Labors”, sagte sie. „Deshalb hat die Arbeit so viele Autoren, darunter mehrere Studenten und Postdocs, die mit mir arbeiten, James Spudich und Daniel Bernstein.

„Es ist wissenschaftlich bedeutsam, aber auch befriedigend, dass dieser Grad der Integration es ermöglicht, diese Idee in mehreren Maßstäben zu testen molekulare Messungen und Berechnungen sowie die von Zellen abgeleiteten Messungen, die es uns ermöglichen, eine einzelne Mutation genetisch zu verändern und zu sezieren”, sagte Pruitt. “Das ist wirklich phänomenal, direkt zu testen, wie eine bestimmte Mutation Veränderungen einführt, die zu HCM führen.”

Als Ergebnis dieser Zusammenarbeit fügte Pruitt hinzu: „Wir können verstehen, was auf Zellebene vor sich geht. Dann können wir damit beginnen, Modelle zu entwickeln und Medikamententherapien der nächsten Generation zu identifizieren. Anstatt nur die Symptome zu identifizieren, können wir uns die Mechanismen ansehen.“ die den Dysfunktionen zugrunde liegen und diese dann auf Zellebene angehen, bevor daraus eine Krankheit wird.”

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