Barcodierte virale Verfolgung von Einzelzellinteraktionen bei Entzündungen des Zentralnervensystems

Einzelzellanalyse von ZNS-Wechselwirkungen

Trotz ihrer Bedeutung für die Physiologie und Pathologie des Zentralnervensystems (ZNS) stehen nur wenige Methoden zur unvoreingenommenen, systematischen Untersuchung von Zell-Zell-Wechselwirkungen bei Einzelzellauflösung zur Verfügung. Clark et al. entwickelten RABID-seq, eine Methode, die Barcode-Virus-Tracing mit Einzelzell-RNA-Sequenzierung kombiniert (siehe die Perspektive von Silvin und Ginhoux). RABID-seq identifizierte die Axon-Leitmoleküle Sema4D-PlexinB2 und EphrinB3-EphB3 als Mediatoren von Mikroglia-Astrozyten-Wechselwirkungen, die die ZNS-Pathologie bei experimenteller Autoimmun-Enzephalomyelitis und möglicherweise Multipler Sklerose fördern. Diese Studien identifizierten auch therapeutische Kandidatenmoleküle für die Modulation von Mikroglia-Astrozyten-Wechselwirkungen bei Multipler Sklerose.

Wissenschaft, diese Ausgabe p. eabf1230; siehe auch p. 342

Strukturierte Zusammenfassung

EINFÜHRUNG

Gliazellen des Zentralnervensystems (ZNS), einschließlich Astrozyten und Mikroglia, spielen eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung, Gewebereparatur und Homöostase. Dysregulierte Astrozyten- und Mikroglia-Reaktionen tragen jedoch zur Pathogenese neurologischer Erkrankungen bei. In der Tat wurde gezeigt, dass Umweltchemikalien, mikrobielle Metaboliten und Zell-Zell-Wechselwirkungen krankheitsfördernde Reaktionen in Astrozyten und Mikroglia im Zusammenhang mit Multipler Sklerose (MS) und ihrem Modell, der experimentellen Autoimmunenzephalomyelitis (EAE), modulieren. Obwohl bekannt ist, dass Astrozyten-Wechselwirkungen mit Mikroglia eine wichtige Rolle bei der Pathologie von MS und anderen neurologischen Erkrankungen spielen, sind die Wege, die das Übersprechen zwischen Astrozyten und Mikroglia erleichtern, kaum verstanden, und folglich sind nur wenige therapeutische Erfindungen verfügbar, um sie anzugehen.

RATIONALE

Um die Komplexität des Astrozyten-Mikroglia-Übersprechens bei ZNS-Entzündungen zu verstehen, müssen präzise Neuroimmun-Wechselwirkungen in vivo untersucht werden. Die Methoden zur Definition der spezifischen Zelltypen, -pfade und -moleküle, die diese Wechselwirkungen vermitteln, sind jedoch begrenzt. Wir entwickelten eine virusbasierte Barcodierungsmethode zur Identifizierung von Tausenden von ZNS-Zellinteraktionen in vivo und zur gleichzeitigen Analyse des Transkriptoms interagierender Zellen mit Einzelzellauflösung. Wir haben diese Technik, genannt Tollwut-Barcode-Interaktionserkennung, gefolgt von Sequenzierung (RABID-seq), auf die Untersuchung der Mikroglia-Astrozyten-Kommunikation im Zusammenhang mit ZNS-Entzündungen bei EAE und MS angewendet.

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ERGEBNISSE

Um RABID-seq zu entwickeln, haben wir eine mRNA-Barcode-Bibliothek im Glykoprotein-G-defizienten Pseudorabies-Virus (RabΔG-BC) konstruiert, das sich zwischen interagierenden Zellen ausbreitet, sich aber nur in Zellen replizieren kann, die virales Glykoprotein G transgen exprimieren. Wir haben das RabΔG-BC pseudotypisiert Plasmidbibliothek unter Verwendung von Hüllprotein der Verpackung der Untergruppe A (EnvA). Somit infiziert das pseudotypisierte Virus nur Zellen, die den EnvA-Rezeptor TVA transgen exprimieren. Nach seiner Replikation in Zellen, die TVA und virales Glykoprotein G exprimieren, infiziert RabΔG-BC interagierende Zellen und markiert sie mit dem viruscodierten Barcode. Um die RABID-seq-Astrozyten-Wechselwirkungen in vivo während einer ZNS-Entzündung im EAE-Modell von MS zu untersuchen, verwendeten wir transgene Mäuse, die Glykoprotein G und TVA in Astrozyten unter der Kontrolle des exprimieren Gfap Promoter. Diese Studien identifizierten mehrere Axon-Leitmoleküle als kritische Mediatoren für Mikroglia-Astrozyten-Wechselwirkungen im Zusammenhang mit Entzündungen. Durch Kombination von RABID-seq mit genetischen Störungsstudien in vivo, Validierung mit primären Maus- und Humanzellen in vitro und Analyse von MS-Patientenproben durch Immunfärbung und Einzelzell-RNA-seq konnten wir feststellen, dass Mikroglia-Astrozyten-Wechselwirkungen durch Sema4D- vermittelt werden. PlexinB1, Sema4D-PlexinB2 und Ephrin-B3-EphB3 fördern die ZNS-Pathologie bei EAE – und möglicherweise bei MS. Insbesondere war Ephrin-B-EphB3 an der Vorwärts- und Rückwärtssignalisierung beteiligt, die sowohl die mikroglia- als auch die astrozytenpathogenen Aktivitäten über die Regulation des Kernfaktors κB bzw. des Säugetierziels von Rapamycin verstärkte. Schließlich haben wir gezeigt, dass ein ZNS-durchdringender niedermolekularer Inhibitor der Kinaseaktivität der intrazellulären EphB3-Domäne die EAE sowohl in akuten als auch in chronisch progressiven Modellen verbessert.

FAZIT

Wir haben RABID-seq entwickelt, einen neuartigen Ansatz zur gleichzeitigen Untersuchung von Zellinteraktionen und des Transkriptoms interagierender Zellen in vivo mit Einzelzellauflösung. RABID-seq identifizierte Signalwege, die von den Axon-Leitmolekülen Sema4D-PlexinB1, Sema4D-PlexinB2 und Ephrin-B3 / EphB3 gesteuert werden, als Mediatoren von Mikroglia-Astrozyten-Wechselwirkungen, die die ZNS-Pathogenese fördern, und als Kandidatenziele für therapeutische Interventionen bei neurologischen Erkrankungen.

Aufklärung von Mikroglia-Astrozyten-Wechselwirkungen durch Nachweis von Tollwut-Barcode-Wechselwirkungen und anschließende Sequenzierung (RABID-seq).

Pseudotypisiertes Tollwutvirus, das barcodierte mRNA-Ziele exprimiert Gfap+ Astrozyten, wo es sich repliziert, bevor es benachbarte Zellen infiziert, und eine barcodierte Spur hinterlässt. Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung liest sowohl zelluläre mRNAs als auch virale Barcodes und ermöglicht so die Rekonstruktion von In-vivo-Zellinteraktionen und die Transkriptionsanalyse interagierender Zellen mit Einzelzellauflösung.

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Aufklärung von Mikroglia-Astrozyten-Wechselwirkungen durch Nachweis von Tollwut-Barcode-Wechselwirkungen und anschließende Sequenzierung (RABID-seq).

Pseudotypisiertes Tollwutvirus, das barcodierte mRNA-Ziele exprimiert Gfap+ Astrozyten, wo es sich repliziert, bevor es benachbarte Zellen infiziert, und eine barcodierte Spur hinterlässt. Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung liest sowohl zelluläre mRNAs als auch virale Barcodes und ermöglicht so die Rekonstruktion von In-vivo-Zellinteraktionen und die Transkriptionsanalyse interagierender Zellen mit Einzelzellauflösung.

Abstrakt

Zell-Zell-Wechselwirkungen steuern die Physiologie und Pathologie des Zentralnervensystems (ZNS). Um die Wechselwirkungen von Astrozytenzellen in vivo zu untersuchen, entwickelten wir den Nachweis von Tollwut-Barcode-Wechselwirkungen, gefolgt von der Sequenzierung (RABID-seq), die die barcodierte Virusverfolgung und die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) kombiniert. Unter Verwendung von RABID-seq identifizierten wir Axon-Leitmoleküle als mögliche Mediatoren für Mikroglia-Astrozyten-Wechselwirkungen, die die ZNS-Pathologie bei experimenteller Autoimmunenzephalomyelitis (EAE) und möglicherweise Multipler Sklerose (MS) fördern. In-vivo-EAE-Studien zur zellspezifischen genetischen Störung, In-vitro-Systeme und die Analyse von MS-scRNA-seq-Datensätzen und ZNS-Gewebe ergaben, dass Sema4D und Ephrin-B3, die in Mikroglia exprimiert werden, Astrozytenantworten über PlexinB2 bzw. EphB3 kontrollieren. Darüber hinaus unterdrückte ein ZNS-durchdringender EphB3-Inhibitor die proinflammatorischen Reaktionen von Astrozyten und Mikroglia und verbesserte die EAE. Zusammenfassend identifizierte RABID-seq Mikroglia-Astrozyten-Wechselwirkungen und mögliche therapeutische Ziele.

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